人参皂苷Rgl及其代谢产物的药代动力学研究
冯 亮, 胡昌江*, 余凌英
(成都中医药大学药学院, 四川 成都 610041)
摘要: 研究静注和灌胃给予一定量人参皂苷Rg1后, 其原形和3种代谢产物的药代动力学。以Wistar大鼠为模型动物, 以LC-MS/MS法测定血浆中人参皂苷Rg1及其代谢产物的浓度, 并计算药代动力学参数。灌胃给药后, 在血浆中检测到人参皂苷Rg1、Rh1、F1和原人参三醇4种物质。其Tmax分别为0.92、3.64、5.17和7.30 h, MRT分别为2.68、5.06、6.65和5.33 h, AUC0−t为2 363.5、4 185.5、3 774.3和396.2 ng·mL−1·h。静注给药后, 在血浆中检测到人参皂苷Rg1、Rh1和F1 3种物质。其T1/2β分别为3.12、5.87和6.87 h, MRT分别为1.92、5.99和7.13 h, AUC0−t分别为1 454.7、597.5和805.6 ng·mL−1·h。结果表明灌胃给药后, 大鼠体内的人参皂苷Rg1代谢产物的量超过原形药, 且代谢产物的吸收和消除速率相对缓慢。静注给药后, 大鼠体内的人参皂苷Rg1以原形为主, 但仍有少量代谢产物存在, 且代谢产物的吸收和消除速率相对缓慢。
关键词: 人参皂苷Rg1; 代谢产物; LC-MS/MS; 药代动力学
中图分类号: R969 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2010) 05-0636-05
Pharmacokinetics of ginsenosides Rg1 and its metabolites in rats
FENG Liang, HU Chang-jiang*, YU Ling-ying
(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610041, China)
Abstract: To study the pharmacokinetics of ginsenosides Rg1 and its metabolites after iv and oral admini-stration in Wistar rats, the LC-MS/MS method was selected to determine ginsenosides Rg1 and its metabolites in plasma and their pharmacokinetic parameters were calculated. After oral administration of ginsenosides Rg1 to rats, ginsenosides Rg1, Rh1, F1 and protopanaxatriol (Ppt) could be detected in plasma. Their Tmax were 0.92, 3.64, 5.17, and 7.30 h, respectively; MRT were 2.68, 5.06, 6.65, and 5.33 h, respectively; AUC0−t were 2 363.5, 4 185.5, 3 774.3, and 396.2 ng·mL−1·h, respectively. After iv administration of ginsenosides Rg1 to rats, ginsenosides Rg1, Rh1 and F1 could be detected in plasma. Their T1/2βs were 3.12, 5.87, and 6.87 h, respectively; MRTs were 1.92, 5.99, and 7.13 h, respectively; AUC0−ts were 1 454.7, 597.5, and 805.6 ng·mL−1·h, respectively. So, it can be concluded that after oral administration, the amounts of metabolites were higher than the prototype in vivo, and the distribution and elimination of the metabolites were relatively slow. After iv administration, the amount of prototype were higher than that of the metabolites in vivo, and the distribution and elimination of the metabolites were relatively slow.
Key words: ginsenoside Rg1; metabolite; LC-MS/MS; pharmacokinetics
三七 [Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen] 是我
国的传统珍贵药材, 具有止血、散瘀、消肿、止痛等功效。研究表明, 三七中的达玛烷型四环三萜皂苷是
收稿日期: 2009-11-04.
基金项目: 四川省教育厅基金课题 (07ZB019). *
通讯作者 Tel: 86-28-85500123, E-mail: hhccjj@163.com
其主要有效成分之一, 所含的皂苷包括两类, 即原人参二醇型和原人参三醇型。人参皂苷Rgl (ginsenoside Rgl, Rgl) 属于原人参三醇型[1], 是三七中主要的皂苷成分, 具有益智、抗衰老、提高神经系统功能[2, 3]等作用。
对Rgl的药代动力学研究始于20世纪80年代。研究发现, Rgl在体内呈二室模型, 其体内吸收迅速,
冯 亮等: 人参皂苷Rgl及其代谢产物的药代动力学研究
· 637 · 消除速率较快[4]。此外, Rg1在肠道菌群的作用下可以被迅速代谢, 在人肠道内代谢途径为Rg1→Rh1 (ginse-noside Rh1, Rh1)→原人参三醇 (20S-protopanaxatriol, Ppt), 而在大鼠肠道内代谢途径为Rg1→Rh1/F1 (gin-senoside F1, F1)→Ppt, 其中Rh1/F1互为同分异构体[5], 其分子结构式如图1所示。到目前为止, Rg1的药代动力学研究多限于药材与各种制剂中的原形药物考察, 并未涉及到其代谢产物。因此, 本文以Wistar大鼠为模型动物, 分别采用静注和灌胃法给予一定量Rg1, 然后测定给药后不同时间点大鼠血浆中Rg1原形和各种代谢产物的含量, 以此考察不同给药途径下Rgl及其代谢产物的药代动力学。
分成2组, 每组6只, 试验前禁食不禁水12 h。一组灌胃给予Rg1提取物溶液, 剂量150 mg·kg−1, 给药后15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、3.5 h、4 h、6 h、8 h、12 h和24 h于尾静脉取血0.4 mL; 另一组股静脉注射给予Rg1提取物溶液, 剂量10 mg·kg−1, 给药后5 min、10 min、15 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h和24 h于尾静脉取血0.4 mL。血样置肝素化离心管。离心 (4 000 r·min−1, 5 min) 分离血浆, 置−20 ℃保存待测。
血浆样品处理 采用HSE-12A固相萃取仪为固相萃取辅助装置。将SPE柱先后用甲醇和水各2 mL活化。取血浆0.1 mL移入已活化的SPE柱, 减压使其恒速通过SPE柱。然后用水2 mL清洗小柱, 抽干, 最后用甲醇1.5 mL洗脱。收集洗脱液, 40 ℃水浴中N2流下吹干。残留物用流动相0.1 mL充分溶解后, 经自动进样器进样20 μL, 进行LC-MS/MS分析。
方法学考察 分别取Rg1、Rh1、F1和Ppt对照
Figure 1 Molecular structure of ginsenoside Rgl (Rgl) and its
metabolites. Rh1: Ginsenoside Rh1; F1: Ginsenoside F1; Ppt: 20S-protopanaxatriol
品适量, 等比稀释成一系列不同浓度的对照品溶液。取不同浓度的对照品溶液0.1 mL, 分别加入大鼠空白血浆0.1 mL, 按“血浆样品处理方法”处理后进样分析, 以测得的峰面积 (A) 对血药浓度 (C) 作线性回归。
同法配制低、中、高3个浓度的Rg1、Rh1、F1
和Ppt样品溶液, 按“血浆样品处理方法”操作, 随标准曲线同时测定, 计算方法回收率和日内、日间精密度, 以提取后的色谱峰面积与空白血浆提取后加入对照品溶液后进样获得的峰面积之比, 考察方法的提取回收率。
数据处理 药−时数据采用3P87药代动力学程序进行模型拟合, 以AIC值和F检验结果确定最佳房室模型, 并计算各药代动力学参数。其中AUC0−t采用梯形法计算, MRT采用统计矩法进行计算, 与房室模型无关。
材料与方法
仪器与试剂 美国AB公司API 3000型液相色谱−三级四极杆质谱联用仪, 配有电喷雾离子源 (ESI); Agilent 1100液相色谱系统; TDL-5台式高速离心机; GM-0.33A隔膜真空泵; HSE-12A固相萃取仪; Agela Cleanert ODS-Cl8 SPE柱 (100 mg, 1 mL); CM- 12水浴式氮吹仪。Rg1提取物购自云南特安纳制备厂, 纯度≥95%, 生产批号DFC2SQ29901; Rg1、Rh1、F1和Ppt对照品购自中国药品生物制品检定所。
实验动物 Wistar大鼠 (由成都中医药大学动物试验中心提供, 合格证号: 川动字1136号) 12只, 雌雄各半, 体重 (250 ± 25) g, 试验前饲养7 d。
色谱与质谱条件 色谱柱为Dikma Diamonsil C18柱 (200 mm × 2.1 mm ID, 5 μm); 流动相为乙腈-水 (28∶72); 流速1.0 mL·min−1; 柱温30 ℃。电喷雾ESI源; 喷雾电压4 kV; 雾化温度380 ℃; 雾化气10 L·min−1; 加热辅助气7 L·min−1; 帘气12 L·min−1; 碰撞气3 L·min−1; 检测方式为正离子多离子反应监测 (MRM), 用于定量分析的离子分别为m/z 801.0→ 441.0 (Rg1)、m/z 639.0→ 441.0 (Rh1)、m/z 639.0→ 405.0 (F1)、m/z 477.0→ 228.0 (Ppt)。
给药方案与血样采集 Wistar大鼠12只, 随机
结果
1 方法学评价
本方法中Rg1、Rh1、F1和Ppt的保留时间分别为7.6、16.5、18.1和23.5 min, 血浆中内源性物质不干扰测定, 见图2～图4, 各色谱峰的理论塔板数在 1 100～1 600之间, 对称因子在1.02～1.15之间。各组分的回归方程、线性范围、相关系数和检测限见表1。各组分在低、中、高浓度下的回收率和日内、日间精密度结果见表2; 经考察, 血浆样品中各组分经
· 638 ·
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (5): 636−640
Figure 2 Chromatograms of blank plasma (A), blank plasma spiked with Rgl, Rhl, Fl and Ppt (B), and plasma sample (C) after oral administration of 150 mg·kg−1 herbal extracts of Rg1
Figure 4 Second mass-spectrogram of Rgl (A), Rhl (B), Fl (C) and Ppt (D)
Table 1 Calibration curves of ginsenoside Rgl and its metabo-lites in plasma (n = 6)
GinsenosideRgl Rhl Fl Ppt
Calibration curve Linear range LOD
r −1
/ A = aC + b /ng·mL /ng·mL−1
A = 5.15×103C + 2 219 2 400−4.69 0.998 72.34 A = 3.22×103C + 109 A = 3.74×10C + 1 158 A = 1.73×10C + 2 947
33
1 400−2.73 0.997 91 600−3.13 9.999 11 100−2.15 0.998 1
1.37 1.56 1.07
Table 2 Recovery and precision of ginsenoside Rgl and its
metabolites in plasma (n = 5, x± s)
Ginsenoside
Rgl Rhl Fl Ppt
Recovery/% Precision RSD/%Concentration
−1
/ng·mL Absolute Relative Inter-dayIntra-day
9.38 150 1 200
5.47 87.5 700 6.25 100 800 4.30 68.75 550
67.9 ± 7.3 97.7 ± 7.7 76.5 ± 8.0 101.2 ± 6.5 70.3 ± 5.5 95.2 ± 9.3 65.1 ± 6.2 98.4 ± 10.8 78.8 ± 6.8 94.6 ± 11.2 69.3 ± 3.9 99.8 ± 6.6 70.6 ± 4.7 98.5 ± 7.5 77.4 ± 6.3 102.7 ± 5.9 68.8 ± 5.2 100.6 ± 10.2 77.9 ± 8.6 95.9 ± 8.7 69.6 ± 7.6 99.4 ± 4.9 73.3 ± 5.8 97.2 ± 9.5
8.4 5.2 6.6 6.2 5.5 2.3 6.9 4.4 7.2 8.8 3.9 1.7
11.4 9.9 7.3 8.5 2.6 3.7 9.7 5.4 2.6 9.3 4.3 4.4
Figure 3 First mass-spectrogram of blank plasma spiked
with Rgl, Rhl, Fl and Ppt (A), and plasma sample (B) after oral administration of 150 mg·kg−1 herbal extracts of Rg1
冯 亮等: 人参皂苷Rgl及其代谢产物的药代动力学研究
· 639 · 过3个冷冻−解冻循环和−20 ℃条件下保存30 d及制
1/C2)。由图可见, 静注给药5 min后血中Rgl的浓度最高, 然后迅速下降, 4 h后即检测不到。代谢产物Rhl和Fl分别在给药后1 h和2 h出现在血液中, 并分别在4.46 h和5.73 h达到浓度峰值。与灌胃给药不同, 静注Rgl后不能在血中检测到Ppt的存在。将测得的药−时数据采用3P87程序处理得到各主要药代动力学参数, 结果见表4。
备的样品室温放置至少8 h后仍保持稳定。 2 药代动力学
Wistar大鼠灌胃给予Rgl溶液150 mg·kg−1后, 测得的Rgl及其代谢产物的药−时曲线见图5, 其在大鼠体内的动力学行为均符合二房室开放模型 (权重1/C2)。由图可见, 灌胃给药15 min即可在血中检测到Rgl的存在, 大约1 h血药浓度达到峰值, 然后迅速下降, 8 h后即检测不到。Rgl的中间代谢产物Rhl和Fl大约在给药后1 h可在血中测到, 并分别在给药后3.64 h和5.17 h达到浓度峰值。最终代谢产物Ppt大约在给药3 h后出现在血中, 并在给药后7.30 h达到浓度峰值。3种代谢产物在给药后24 h仍可在血中检出。将测得的药−时数据采用3P87程序处理得到各主要药代动力学参数, 结果见表3。
Figure 6 Mean plasma concentration-time curves of ginsenoside Rgl and its metabolites after iv administration of 10 mg·kg−1 herbal extracts of Rg1 (n = 6, x± s)
Table 4 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rgl and its metabolites after iv administration of 10 mg·kg−1 herbal extracts of Rg1 (n = 6, x± s)
Parameter Rgl Rhl
Fl 4.1 ± 1.3 0.13 ± 0.05 0.23 ± 0.10 6.87 ± 2.95 0.035 ± 0.014
α / h−1 β / h−1 T1/2α / h T1/2β / h Vc / L·kg−1 CLs / mL·kg−1·h−1
2.2 ± 0.8 0.28 ± 0.11 0.37 ± 0.13 3.12 ± 1.64 0.021 ± 0.009 0.037 ± 0.017
2.9 ± 1.1 0.16 ± 0.04 0.30 ± 0.14 5.87 ± 2.66 0.028 ± 0.011
Figure 5 Mean plasma concentration-time curves of ginsenoside Rgl and its metabolites after oral administration of 150 mg·kg−1 herbal extracts of Rg1 (n = 6, x± s)
Wistar大鼠静注给予Rgl溶液10 mg·kg后, 测得的Rgl及其代谢产物的药−时曲线见图6, 其在大鼠体内的动力学行为仍符合二房室开放模型 (权重
−1
0.009 ± 0.005 0.016 ± 0.006597.5 ± 274.3 805.6 ± 233.75.99 ± 3.03
7.13 ± 2.25
AUC0−t / ng·mL−1·h1 454.7 ± 446.2 MRT / h
1.92 ± 0.23
Table 3 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rgl and its metabolites after oral administration of 150 mg·kg−1 herbal extracts of Rg1 (n = 6, x± s)
Parameter Rgl Rhl α / h−1 β / h−1 Cmax / ng·mL−1 T max / h T1/2α / h T1/2β / h Vc / L·kg−1 CLs / mL·kg−1·h−1 AUC0−t / ng·mL·h MRT / h
Fl Ppt 4.0 ± 1.0 0.17 ± 0.05 522 ± 198 5.17 ± 0.93 0.22 ± 0.08 5.44 ± 1.44 0.020 ± 0.007 0.022 ± 0.005 3 774.3 ± 889.6 6.65 ± 2.17
4.4 ± 1.4 0.22 ± 0.06 38 ± 23 7.30 ± 2.0 0.20 ± 0.04 5.06 ± 0.9 0.027 ± 0.011 0.011 ± 0.006 396.2 ± 203.4 5.33 ± 3.20
7.4 ± 2.9 0.46 ± 0.16 1134 ± 563 0.92 ± 0.12 0.14 ± 0.05 2.25 ± 0.68 0.008 ± 0.002 0.031 ± 0.014 2 363.5 ± 856.6 2.68 ± 0.36
−1
3.6 ± 0.8 0.12 ± 0.05 585 ± 117 3.64 ± 1.43 0.29 ± 0.09 6.73 ± 2.28 0.015 ± 0.04 0.017 ± 0.08
4 185.5 ± 1 394.7
5.06 ± 1.33
· 640 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (5): 636−640
讨论
灌胃给药后, Rgl、Rhl、Fl和Ppt的分布相半衰期和消除相半衰期表明原形药物在体内的分布和消除速率均较快, 但代谢产物的消除速率相对较慢, 其平均滞留时间MRT也比原形高。Odani等[6]发现Rgl的口服生物利用度仅为1.9%～20%。而霍玉书等[7]灌胃给予小鼠3H-Rgl后, 发现其生物利用度可达49%, 并推断是代谢产物被吸收入血的缘故。本实验证实了这一推断, 若仅考虑原形药物, 则Rgl的口服生物利用度仅为10.82%。但是其水解掉一分子葡萄糖的代谢产物Rhl和Fl在血液中浓度较高, 两者的AUC0−t均超过原形。Ppt在血液中的浓度比较低, 其AUC0−t也较小, 但是其代谢缓慢, 24 h后仍能在血中检出, 因此不能忽视。
Rhl和Fl的平均滞留时间MRT静注给药后, Rgl、
分别为1.92、5.99和7.13 h, 说明Rgl在体内消除较快, 而代谢产物的体内消除相对缓慢; 药-时曲线下面积表明相对于灌胃给药而言, 静注给药后有更多的Rgl以原形存在于体内, 代谢产物的比例相对较低。研究[8]发现, 大鼠静脉注射Rgl 15 mg·kg−1后, 4 h胆汁中累积排泄量为剂量的57.2%, 12 h内尿累积排泄量为剂量的23.5%, Rgl 经尿、胆汁共排出80%以上, 说明其体内代谢并不明显。因此, 静注Rgl后血液中代谢产物的来源应该是部分Rgl通过胆汁排入肠道, 在肠道内发生水解后, 水解产物再吸收入血。排泄、水解和再吸收过程需要时间, 因此, 在给药一段时间后才能再出现在血中。Ppt不能被检出, 原因可能有: ① 给药剂量小导致Ppt的血药浓度过低; ② Ppt在肠道中出现时间过晚, 错过了最佳吸收部位以至于不能吸收。
总之, 无论是口服还是静注给予Rgl, 其代谢产物在体内均普遍存在, 且浓度水平高, 消除缓慢。因此, 有必要进一步对代谢产物的药理学、药效学性质
[9]
进行考察, 并对原形与代谢产物在生物活性方面的异同进行深入研究, 以期阐明传统三七制剂中发挥作用的真正有效成分。
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